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Cell culture powder medium으로 멸균된 cell culture liquid medium 만들기

Powder 형태의 배지와 염은 수분 친화적이므로 반드시 건조된 환경에서 보관해야 합니다. 한번 패키지를 열게 되면 한번에 다 녹이도록 해야 합니다.

각기 다른 종류의 아미노산이 용해성 문제로 가라앉을 수 있으므로 powder form은 1x 용량으로 녹입니다. 농축된 수용액에서는 낮은 용해성으로 인해 염을 생성할 가능성을 포함하고 있습니다. 추가적인 보충물이 필요하다면, 멸균하지 않은 채로 filtration 하기 전에 첨가하거나, 멸균 후 필트레이션 후에 첨가합니다.

Powder media를 녹일 때는 2차 멸균수나 탈염 증류수, pryrogen-free 증류수를 사용합니다.

Procedure 1: Preparing sterile filtered liquid media

1) powder 형태의 medium에 필요한 만큼 물을 첨가합니다. (차후에 pH를 맞추기 쉽도록 90% 정도의 물을 사용합니다.) 용기에 남은 powder를 씻어냅니다. 완전히 녹을때까지 마그네틱 바를 이용해서 녹입니다. 수온은 15-30 ℃사이에서 합니다.

2) powder가 완전히 녹으면, sodium hydrogen carbonate를 첨가하고 완전히 녹입니다.

3) stirring하면서 1N HCl, 혹은 1N NaOH를 첨가해서 적합한 pH 값 (생리적인 적정선은 pH 6.8 – 7.2)을 조정합니다.

※  Note : pH 값은 배지의 적정 pH 보다 0.2 낮게 맞춰야 합니다. 왜냐햐면 CO₂ 가 새어 나올 때 filtration 하는 동안 pH가 점진적으로 증가하기 때문입니다.

4) pH를 조정하고 난 후, 물을 첨가해 최종 부피를 맞추고 잘 섞습니다. 멸균된 조건에서 즉시 filter를 해서 멸균합니다.

5) 빛이 닿지 않도록 해서 2-8 ℃에서 보관합니다.

Procedure 2: Preparing liquid media from autoclavable powder media

1) powder 형태의 medium에 필요한 만큼 물을 첨가합니다. (차후에 pH를 맞추기 쉽도록 90% 정도의 물을 사용합니다.) 용기에 남은 powder를 씻어냅니다. 완전히 녹을때까지 마그네틱 바를 이용해서 녹입니다 . 수온은 15-30 ℃사이에서 합니다.

2) 수용액의 pH를 확인합니다. pH 값은 4.1 정도가 되어야 합니다. 필요하다면, 1N HCl 수용액을 사용해서 pH를 맞춥니다.

3) 최대 500ml을 분주해서 준비합니다. 이 분주한 배지의 뚜껑은 고압멸균하는 동안 오염되지 않도록 조금만 열어놔야 합니다. 121 ℃에서 15분간 고압멸균합니다.

4) 고압멸균이 끝난 후, 상온에서 배지를 식힙니다.

5) 멸균된 조건에서 멸균해서 필터한 7.5% sodium hydrogen carbonate를 첨가합니다.

※  Note : 멸균된 glutamine, serum이나 기타 열에 민감한 첨가물 (항생제나 growth factor) 들은 고압멸균이 끝난 뒤 첨가합니다.

6) 수용액의 pH 값을 확인합니다. Mammalian cell 의 생리적인 적정 값은 pH 6.8-7.2 입니다. 필요하다면, 멸균된 1N HCl이나 1N NaOH로pH 값을 맞춥니다.

7) pH를 맞추고 난 후 멸균수를 넣어 최종 부피를 맞추고 잘 섞습니다.

8) 배지를 빛이 닿지 않는 곳에서 2-8 ℃에서 보관합니다.

Procedure 3: Preparing liquid insect cell culture media

1) powder 형태의 medium에 필요한 만큼 물을 첨가합니다. (차후에 pH를 맞추기 쉽도록 90% 정도의 물을 사용합니다.) 용기에 남은 powder를 씻어냅니다. 완전히 녹을때까지 마그네틱 바를 이용해서 녹입니다 . 수온은 15-30 ℃사이에서 합니다.

2) powder가 완전히 녹으면, sodium hydrogen carbonate를 첨가하고 완전히 녹입니다.

3) stirring하면서 1N HCl 혹은 1N NaOH를 사용해서 pH를 6.3으로 맞춥니다.

※  Note : pH는 대략 설정 pH보다 0.2 정도 낮은 6.1이 되야 합니다. 왜냐하면 filtration동안 CO₂ 가 누출되면 pH가 점진적으로 증가하기 때문입니다.

※  Comment : insect cell 의 생리적인 적정 pH는 mammalian과 비교해서 더 산성에 가깝습니다. pH 6.5 이상의 pH에서는 insect cell culture media에 포함된 고농도의 calcium chloride가 침전되는 일이 발생합니다.

4) pH를 맞춘 후, 증류수를 첨가해서 최종 부피를 맞춰줍니다. 잘 섞은 후 즉시 filter를 합니다.

5)  배지를 빛에 닿지 않도록 해서 2-8 ℃ 에서 보관합니다.