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[ 개요 ]

마이코플라스마에 의한 세포 배양의 오염은 흔한 문제점입니다. 마이코플라스마 오염은 세포의 면역학적 특징은 물론이고 생화학적 변화까지도 초래합니다. 생물학적인 원인과 경제적인 원인으로도, 기초 개발, 진단, 생물학적 기술 제품의 생산에 있어서 사용되는 세포들로부터 마이코플라스마를 완전히 제거하는 것은 중요한 일입니다. 세포 배양시 마이코플라스마의 제거, 비활성화, 억제에 가장 흔하게 사용되는 방법은 항생제를 조치하는 것입니다. 그러나 항생제 치료는 지속적인 제거에는 실패할 수 있습니다. 또한, 세포 독성의 특성을 지닌 항생제는 진핵 세포에 원하지 않는 부작용을 초래할 수 있고, 마이코플라스마 계통의 저항성을 향상시키는 역할을 하기도 합니다.

Myco-4는 기본적인 항생제와 생물학적 제제가 혼합된 형태로 되어 있습니다. 대부분의 박테리아와 비교해서, 마이코플라스마는 세포벽이 없으나 세포질의 막으로 둘러쌓여 있습니다. 포함된 생물학적 제제는 마이코플라스마의 세포막으로 흡수되어서 형태를 압박합니다. 일반적인 항생제와의 조합으로 제제와 항생제 모두 최소한의 독성을 나타내는 농도에서 효과적이며, 확실하게 마이코플라스마를 제거합니다. 이러한 생물리학적 특성은 저항성을 가지는 strain이 발전하는 것을 어렵게 만듭니다.

Myco-4를 한번 사용하는 데 4개의 vial을 사용합니다. Starter treatment와 세개의 main treatment solution으로 되어 있습니다. Starter treatment는 세포에 아무런 해를 미치지 않고 대부분의 마이코플라스마 파티클을 죽이는 역할을 합니다. Main treatment 는 지속적인 근절을 유도하기 위해 남아있는 모든 파트클들을 죽입니다.

[ 구성 ]

  각각의 키트는 한 개 vial의 Starter Treatment solution과 3 vial의 Main Treatment solution으로 되어 있습니다. 각각의 구성품은 멸균되어 있으며, ready-to-use 형태의 수용액으로, 각각의 적용되는 양만큼 약 520ul/vial로 분주되어 있습니다.

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[ 사용 방법 ]

아래 실험 방법은 일반적인 배지를 사용하는 전형적인 cell line에 맞게 명시되었습니다. suspension cell line과 마찬가지로 adherent cell line에도 적합합니다. 개인의 경우에 맞추어 실험 방법을 변형시키는 것이 필요할 수 있습니다.

1. 멸균된 배양용 플라스크나 페트리디쉬에 4.5ml의 세포배양 배지를 섞습니다. (5% v/v FCS 포함) 그리고 500 ul의 Myco-4 Starter Treatment(붉은 색 뚜껑의 바이알)를 첨가합니다.

2. 5ml의 10⁴ – 10⁵ single cell 이 포함된 세포 배양 배지를 옮겨서 섞습니다 (5% FCS 포함). 세포 수를 정확히 하고 세포가 뭉쳐 있는 것이 보이지 않도록 합니다!

Treatment mixture의 종합 부피는 10ml이며, 최종 serum의 농도는 5% (v/v) 입니다. Serum 농도가 높으면 효과적인 치료가 되지 않습니다.

Single cell 만을 치료할 수 있도록 확인 하십시요 (현미경으로 확인하세요). 필요하다면 trypsin 처리 시간을 늘리거나 pipetting을 통해 cell을 각각 떨어뜨리십시요.

세포를 추가하기 전에 Myco-4가 배지에 먼저 섞였는 지를 확인해 주세요. 증발을 막기 위해 mixture에 직접적으로 세포를 첨가하십시요(pipette tip을 직접적으로 mix에 넣습니다).

3. 세포들이 다시 부착될때까지 배양합니다 (최소 30분), 혹은, 일반적인 배양 시간만큼 배양합니다.

4. Myco-4 Main Treatment Reagent (노란 뚜껑 바이알) 500ul를 새로운 배지에 배양된 세포 9.5ml에 첨가합니다. FCS 농도를 맞춥니다. 5% 이상은 필요하지 않습니다.

5. 80-90% 농도까지 세포를 배양합니다. 일반적인 비율로 세포를 나누고 계대배양합니다.

6. 위 단계를 4-5회 반복합니다.

세번째 치료가 되면 (Starter Treatment solution으로 총 4회 계대배양하면) 모든 치료 과정은 끝나고 마이코플라스마는

완전히 제거됩니다.