(1)    실험에 사용되는 모든 항목들 - 샘플의 양, 1차 Ab, 2차 Ab의 농도, transfer membrane과 blocking agent 등 –을 최적의 조건에 맞게 사용하는 것이 필수적입니다. 좋은 SDS-gel은 좋은 western blot의 결과를 얻기 위한 기본조건입니다. Gel의 전기영동 조건, 로딩하는 샘플의 볼륨 역시 최적화해서 사용해야 합니다.

(2)    CheLuminate-HRP 는 매우 섬세한 광도를 지니므로, 일반적으로 판매하는 ECL이나 colormetric HRP system을 사용할 때보다 Ab의 농도가 확실하게 적을 것입니다. 대략적인 샘플이나 항체의 양을 최적화하기 위해서는 체계적인 dot blot analysis 가 수행되어야 합니다.

(3)    어떠한 blocking reagent도 모든 실험에 최적화된 것은 아닙니다. 그러므로 각각의 Western blot과 ELISA 를 하기 위해서는 정확한 blocking buffer 를 결정하는 것이 필수적입니다. 적절한 blocking buffer를 결정하는 것은 감도를 향상시키고 Ab와 blocking reagent의 교차반응으로 인해 원하지 않은 신호가 함께 잡히는 것을 방지할 수 있습니다.

(4)    Blot 전체를 충분히 덮을 수 있는 충분한 양의 wash buffer, blocking buffer, Ab dilution과 CheLuminate-HRP substrate을 사용해서 절대로 마르지 않도록 하십시요. 많은 양의 blocking 과 washing buffers 는 non-specific signal을 감소시키는 효과도 있습니다.

(5)    Avidin/biotin 계열을 사용할때는 절대로 milk로 blocking 하지 마십시요. milk에는 다양한 종류의 내생적인 (endogeneous) biotin이 포함되어 있습니다.

(6)    최적의 결과를 얻기 위해서는 incubation 단계에 shaking platform을 사용 하십시요.(정체시키지 말고 계속 흔들어줘야 합니다.)

(7)    항체 희석액을 준비할 때는 non-specific signal을 감소시키기 위해서 blocking buffer 에 Tween20 (최종 농도 0.05%)를 첨가하십시요.

(8)    Buffer를 신선하게 보관하기 위해 아지드화 나트륨 (sodium azide)를 첨가하지 마십시요. 아지드화 나트륨은 HRP의 저해제이며 실험결과에 영향을 미칩니다.

(9)    맨손으로 membrane을 다루지 마십시요. 항상 장갑을 착용하거나 깨끗한 포셉 (forcep)을 이용하십시요. 모든 장비들은 세척되어야 하고 외부 물질로부터 오염이 있으면 안 됩니다. 금속성 기기 (예를 들면 가위) 는 반드시 녹이 없어야 합니다. 녹은 작은 반점이나 높은 back ground 신호를 유발할 수 있습니다.